关于NBT染色
NBT染色，全称为硝基四氮唑蓝 (Nitro blue tetrazolium chloride) 染色，是一种广泛应用于生物学和医学研究中的比色法，主要用于检测氧化还原反应的活性，尤其是活性氧（ROS）的生成或某些酶的活性。它基于一种化学反应，能够将无色或淡黄色的可溶性化合物转化为深蓝色的不溶性沉淀，从而在细胞或组织中可视化特定的生化过程。
NBT染色是什么？
NBT，即硝基四氮唑蓝，是一种四氮唑盐化合物。在存在还原剂的情况下，NBT分子会接受电子，发生还原反应。还原产物是一种不溶于水的深蓝色物质，称为甲臜（formazan）。
核心原理：
- NBT (淡黄色，可溶) + 还原剂 (如超氧阴离子自由基 O₂•⁻, 或某些酶反应生成的 NADH/NADPH) → 甲臜 (深蓝色，不溶) + 氧化产物
- 甲臜会在发生还原反应的位置形成蓝色沉淀，从而指示该区域存在还原活性或还原剂。
NBT染色检测什么？
NBT染色并非直接检测某种分子，而是检测具有还原NBT能力的物质或由此产生的反应。其最常见的应用是检测：
检测活性氧 (ROS)，特别是超氧阴离子自由基 (O₂•⁻)
超氧阴离子自由基 (O₂•⁻) 是一种强还原剂，能够直接将NBT还原为蓝色的甲臜。这使得NBT染色成为检测细胞或组织中超氧阴离子生成水平的一种常用方法。例如，在炎症反应、氧化应激、植物对环境胁迫的响应等研究中，NBT染色常被用来可视化和评估O₂•⁻的产生。
化学反应简化表示：
O₂•⁻ + NBT → 氧化产物 + 甲臜 (蓝色沉淀)
检测某些氧化还原酶活性
某些酶，如NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脱氢酶类（如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶等），它们催化底物氧化并产生还原型辅酶 (如NADH或NADPH) 或直接产生超氧阴离子。这些还原型辅酶或产生的超氧阴离子可以进一步还原NBT，形成蓝色沉淀。通过添加特定的酶底物和NBT，可以在细胞或组织切片中定位和评估这些酶的活性。
为何选择NBT染色？
选择NBT染色通常是因为其以下优点：
- 可视化： 产生的蓝色沉淀可以直接在光学显微镜下观察到，提供直观的定位信息。
- 相对简单： 与一些复杂的生化测定方法相比，NBT染色操作相对简便快捷。
- 成本效益： NBT试剂通常价格合理，适用于大规模筛选或基础研究。
- 特异性（在特定条件下）： 在适当的实验条件下，NBT对超氧阴离子具有相对特异性，或者可以通过底物特异性检测特定酶。
NBT染色常用于哪些地方？
NBT染色在多个研究领域有广泛应用：
- 免疫学： 检测吞噬细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）的呼吸爆发（respiratory burst），即NADPH氧化酶产生的超氧阴离子。这是评估吞噬细胞功能的重要指标。
- 植物学： 检测植物在遭受病原体侵染、干旱、高盐、重金属等环境胁迫时产生的活性氧。蓝色的甲臜沉淀通常出现在受损或发生超敏反应的组织区域。
- 细胞生物学： 评估细胞内的氧化应激水平。
- 酶组织化学： 定位组织切片或细胞爬片中具有NBT还原能力的酶的活性分布。
- 生物化学： 在非变性凝胶电泳后，用于检测凝胶中具有脱氢酶活性的条带。
NBT染色如何操作？详细步骤
NBT染色的具体步骤会根据不同的样本类型（细胞悬液、组织切片、凝胶）和目的（检测ROS或酶活）有所调整，但基本流程相似。以下是一个通用的步骤框架：
试剂准备
配制NBT工作液。常用的NBT工作浓度在0.1 mg/mL到1 mg/mL之间，通常用生理盐水、PBS缓冲液或其他合适的缓冲液配制。有时会加入其他成分以增强特异性或反应，例如：
- 检测ROS时，可能只用NBT溶液。
- 检测酶活时，需要加入酶的底物，以及可能需要的辅助因子（如NAD⁺, NADP⁺）。
- 某些方案会加入叠氮化钠 (NaN₃) 抑制内源性过氧化物酶活性，或加入NaNCN抑制细胞色素c氧化酶，以提高对超氧阴离子的特异性检测。
- 配制的溶液通常现配现用，或避光低温保存。NBT对光敏感。
样本处理
根据样本类型进行准备：
- 细胞悬液： 将细胞重悬于合适的缓冲液中，调整细胞密度。
- 组织切片： 冰冻切片或石蜡切片（需进行脱蜡水化）。对于酶组织化学，通常使用冰冻切片以保留酶活性。
- 凝胶： 电泳后的非变性凝胶。
染色步骤
这是关键的孵育过程：
- 将样本（细胞悬液、切片或凝胶）与配制好的NBT工作液充分接触。对于细胞，通常是将细胞沉淀与染液混合；对于切片，是将切片浸入染液或滴加染液覆盖；对于凝胶，是将凝胶浸入染液中。
- 将样本在适当的温度和时间下孵育。孵育条件取决于检测的对象和样本类型：
- 检测细胞ROS：通常在37°C或室温下孵育30分钟到数小时。时间需要优化，直到蓝色沉淀清晰可见但不出现过高背景。
- 检测植物组织ROS：通常在室温或25°C下避光孵育数小时到过夜。
- 检测酶活：孵育温度通常为37°C，孵育时间根据酶的活性而定，可能只需要几分钟到数小时。
整个孵育过程通常需要避光进行，以防止NBT的非特异性光还原。
- 终止反应和清洗：
- 对于细胞或组织切片：孵育结束后，用缓冲液或生理盐水充分洗涤，去除未反应的NBT。然后通常用固定液（如甲醇、乙醇、福尔马林等）固定细胞或组织，以保存形成的蓝色甲臜沉淀，防止其溶解或扩散。固定后再次洗涤。
- 对于凝胶：孵育结束后，用蒸馏水或缓冲液洗涤，去除未反应的NBT。
- （可选）复染：对于组织切片或细胞，可以进行适当的复染（如番红、苏木精等），以便在蓝色沉淀的背景下观察细胞或组织结构。
观察与分析
在光学显微镜下观察细胞或组织切片，或直接观察凝胶。蓝色的甲臜沉淀将出现在发生还原反应的位置。
NBT染色结果如何解读与定量？
结果解读主要基于蓝色甲臜沉淀的出现及其分布：
- 定性观察： 观察是否有蓝色沉淀形成，其颜色深浅（反映活性高低），以及沉淀在细胞或组织中的具体位置（如细胞膜、胞浆、组织损伤部位等）。有蓝色沉淀说明该部位存在可还原NBT的活性物质（如超氧阴离子）或酶。
- 定量分析： 虽然NBT染色是比色法，但也可以进行半定量或定量分析：
- 图像分析： 使用图像分析软件（如ImageJ）测量蓝色沉淀的面积百分比或平均颜色强度，从而比较不同处理组之间的差异。
- 分光光度计法： 特别是对于细胞悬液样本，可以在染色、清洗和固定后，用有机溶剂（如二甲基亚砜 DMSO 或吡啶）裂解细胞并溶解形成的甲臜沉淀。然后测量溶解液在特定波长（通常在560-595 nm之间，甲臜的最大吸收波长）的吸光度值。吸光度越高，表明形成的甲臜越多，对应的还原活性或ROS水平越高。
进行NBT染色时需要注意什么？常见问题与排除
在进行NBT染色时，可能会遇到一些问题：
- 背景染色过高： 整个视野呈现弥漫性的浅蓝色，而不是局限于特定区域的深蓝色沉淀。
可能原因： NBT溶液不纯；孵育时间过长或温度过高；非特异性还原，如样本自身存在大量非目标还原性物质；清洗不充分。
排除方法： 使用高纯度NBT；缩短孵育时间或降低温度；增加清洗次数和时间；在染液中加入抑制剂（如NaN₃）减少非特异性还原。 - 染色信号弱或无信号： 预期有阳性信号但染色很浅甚至没有颜色。
可能原因： 目标活性（ROS或酶活）确实很低；NBT试剂失效（可能因储存不当受潮或受光照）；孵育时间过短或温度过低；酶活样本未加入底物或辅因子。
排除方法： 检查样本处理是否正确；更换新的NBT试剂；延长孵育时间或适当升高温度（需优化）；确保酶活染色的底物和辅因子浓度正确且新鲜。 - 沉淀不均匀： 蓝色沉淀呈斑驳状或仅集中在少数区域。
可能原因： 样本处理不均匀（如细胞未充分分散）；染液未充分覆盖样本；样本在孵育过程中干燥。
排除方法： 确保细胞悬液充分混匀，切片或凝胶完全浸没在染液中；在孵育过程中保持湿润环境。 - 沉淀溶解或扩散： 固定后蓝色沉淀变淡或边界模糊。
可能原因： 固定剂选择不当或固定时间不足，甲臜没有被很好地固定在原位。
排除方法： 尝试不同的固定剂（如甲醇通常用于固定NBT染色的细胞）；增加固定时间。
NBT染色的试剂浓度通常是多少？
NBT的常用储存液浓度通常较高，例如 5 mg/mL 或 10 mg/mL。
工作溶液的浓度则根据不同的应用和样本类型有所不同，常见的范围是：
- 用于细胞或组织ROS检测：通常在 0.1 mg/mL 至 0.5 mg/mL 之间。例如，检测吞噬细胞的呼吸爆发常用浓度为 0.1 – 0.2 mg/mL。检测植物组织ROS时，有时会使用稍高的浓度，如 0.5 mg/mL 或 1 mg/mL。
- 用于酶组织化学或凝胶染色：浓度变化较大，从 0.1 mg/mL 到 1 mg/mL 都有报道，具体取决于酶的活性和所需的检测灵敏度。通常需要通过预实验来优化浓度。
配制时，NBT溶解在纯水或合适的缓冲液（如PBS）中。由于NBT对光敏感，配制和储存时都应避光。储存液通常分装后-20°C避光保存。
总而言之，NBT染色是一种简单而有效的工具，通过蓝色沉淀的可视化，帮助研究人员了解细胞和组织中的氧化还原状态，特别是活性氧的生成和某些酶的活性分布。掌握其原理和操作细节，并注意常见问题的排除，是获得可靠结果的关键。
