【lefse在线分析】是什么？
【lefse在线分析】指的是利用基于Lefse (Linear discriminant analysis Effect Size) 算法的在线工具或平台，对高维数据（尤其是微生物群落研究中的物种丰度数据）进行差异性分析的过程。简单来说，它是一种统计方法，用于识别在不同组别（例如，疾病组与健康组、不同处理组、不同环境样本）之间存在统计学显著差异且效应量（差异大小）较大的特征。这些特征可以是微生物物种、基因、代谢物等，在微生物领域，通常指代在分类学水平或OTU/ASV水平上，某个物种在一个组别中显著富集，而在另一个组别中丰度较低。
数据类型与核心目的
Lefse在线分析主要处理的是丰度数据。对于微生物研究，输入数据通常是：
- 物种（或OTU/ASV）丰度表：行代表不同的物种或特征，列代表不同的样本，表格内容是该物种在对应样本中的丰度值（可以是相对丰度或测序计数）。
- 元数据（Metadata / Mapping File）：一个表格，描述每个样本的属性，其中必须包含用于分组比较的列（如Group: Control vs Treatment, Disease vs Healthy）。
它的核心目的在于从复杂的生物样本中，快速、有效地找出那些能够区分不同组别的“生物标志物”（Biomarkers），即在特定条件下丰度显著改变的特征。
核心输出
一次典型的Lefse在线分析会产生以下主要输出：
- 差异特征列表： 一个文本文件，列出所有被识别为差异的特征，包括它们所属的组别、LDA分值（效应量大小）和统计学P值等信息。
- Cladogram（分类树图）： 一个以树状结构展示的图，将分类学信息与差异丰度结果结合。树的节点和分支代表不同的分类学级别，颜色通常表示该分类单元在哪一组中显著富集，节点大小或亮度可能与LDA分值相关。
- Bar Plot（LDA分值条形图）： 一个条形图，直接展示每个差异特征的LDA分值大小，颜色表示该特征在哪个组别中富集。LDA分值越大，表示差异越显著、效应量越大。
【lefse在线分析】为什么使用它？
在处理高通量测序产生的复杂生物数据时，我们往往需要找到不同条件或组别之间关键的区别点。相比于简单的T检验或方差分析，Lefse算法及其在线工具具有以下显著优势：
优势与特点
1. 专注于差异性与效应量： Lefse算法不仅仅关注统计学上的P值（即差异是否可能是偶然发生的），更结合了LDA分值来衡量差异的“效应量”或“大小”。这意味着它能优先找出那些差异大、更有生物学意义的特征。
2. 处理高维数据： 生物组学数据（如微生物群落）往往具有“高维”特点，即特征数量（物种数）远多于样本数量。Lefse设计之初就考虑到了这种数据结构。
3. 非参数检验： Lefse使用的核心统计方法（Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon秩和检验）都是非参数检验，对数据分布没有严格的要求（如正态分布），这更适用于复杂且通常不服从正态分布的生物丰度数据。
4. 考虑分类学层次结构： 对于微生物数据，Lefse能利用其分类学信息，在不同分类级别上进行分析，并以Cladogram的形式直观展示，帮助理解差异是在哪个分类层面上发生的。
5. 快速易用（在线平台）： 通过在线平台，用户无需安装复杂的软件和依赖库，只需准备好数据文件，通过网页界面上传、设置参数即可运行，大大降低了生物信息学分析的门槛。
与其他方法的独特之处
传统的差异分析方法（如基于方差分析或某些包装成的差异表达分析工具）可能更侧重于P值校正以应对多重检验问题，或依赖于特定的统计模型。而Lefse的独特之处在于它结合了多步检验（Kruskal-Wallis -> Wilcoxon -> LDA）来共同确定差异特征，并且通过LDA分值提供了一个衡量差异大小的标准，使得结果更侧重于发现具有潜在生物学重要性的生物标志物。在线工具则进一步提供了可视化结果，便于非专业人士理解。
【lefse在线分析】哪里可以进行？
进行Lefse在线分析，通常需要访问提供Lefse算法作为其分析模块的生物信息学平台。
主要在线平台介绍
目前，最常用和著名的Lefse在线分析平台包括：
- Galaxy平台： Galaxy是一个广泛使用的、基于网络的生物信息学工作流程平台。许多大型研究机构或数据中心会搭建自己的Galaxy服务器。你可以在公共的Galaxy服务器（如usegalaxy.org）或特定机构提供的Galaxy实例上找到Lefse工具。在Galaxy中，Lefse通常作为一个独立的工具模块存在，用户需要先上传数据，然后在工具列表中找到Lefse并进行参数设置。Galaxy的优势在于其模块化和可重复性。
- 原开发者实验室的网站（Huttenhower Lab）： Lefse算法最初由Huttenhower实验室开发，他们也提供了在线的Lefse网页服务器。用户可以直接访问其网站，上传数据并运行分析。这是一个直接、快速的入口。
- 某些整合分析平台： 一些专注于特定领域（如微生物组）的整合分析平台或数据库，可能会内置Lefse作为其差异分析功能的一部分。使用这类平台可能需要注册账号。
如何选择平台
选择哪个平台取决于你的具体需求和便利性：
- 如果你已经熟悉Galaxy平台，或者你的数据已经在Galaxy中处理过，直接在Galaxy中使用Lefse工具最为方便。
- 如果你只是想快速对少量数据进行Lefse分析，并且数据格式符合要求，直接使用Huttenhower Lab的在线服务器可能更快捷。
- 如果你的数据是来自某个特定的研究项目或数据库，并且该数据库提供了内置的分析工具，那么使用该平台可能更方便地与原始数据关联。
无论选择哪个平台，重要的是确保平台提供的Lefse工具是最新或稳定版本，并且了解其数据格式要求和计算资源的限制。
【lefse在线分析】多少数据量合适？费用如何？
关于数据量和费用是使用在线工具时常关心的问题。
费用情况
绝大多数提供Lefse在线分析的平台，特别是基于学术研究机构的Galaxy服务器或Huttenhower Lab的原始服务器，都是免费提供给学术研究使用的。它们通常是作为科研基础设施或公共服务的一部分。当然，某些商业化的生物信息学分析平台可能将Lefse作为其付费服务套餐的一部分，但这并非主流的Lefse在线使用模式。对于大多数研究人员来说，免费的公共资源已经足够。
数据量与特征数限制
在线平台的计算资源是有限的，因此通常会有一定的数据量和特征数限制。这些限制取决于具体的服务器配置和政策：
- 样本数： 一般来说，Lefse能够处理包含几十到几百个样本的数据集。对于样本量非常大的数据集（例如几千甚至几万个样本），在线平台可能会因为内存或计算时间限制而无法完成，或者排队时间非常长。
- 特征数： 微生物组数据通常包含成千上万甚至数十万的OTU/ASV或分类单元。Lefse算法本身能够处理相当多的特征。在线平台在这方面的限制通常与输入文件的大小有关。如果输入文件（丰度表）过大，可能会超出上传或处理限制。通常，包含几千到几万个特征的数据集是可以在线平台上运行的。
- 文件大小： 有些平台会对上传文件的总大小设置上限（例如，不超过1GB或几GB）。
- 计算时间： 分析复杂或大型数据集需要更长的计算时间，在线平台可能会有单次任务的最大运行时间限制。如果数据量过大，分析可能在完成前被中断。
如果你的数据量非常庞大，超出了在线平台的处理能力，你可能需要考虑下载Lefse的独立版本（通常是Python脚本）并在具有更高计算资源的服务器或本地计算机上运行。
【lefse在线分析】如何使用在线工具？
使用Lefse在线工具的流程大致相似，主要包括数据准备、上传、参数设置和启动分析。
数据准备与格式要求
这是关键的第一步。在线Lefse工具通常要求特定的输入文件格式。最常见的需求是：
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输入数据表： 一个文本文件（通常是.txt或.csv格式），用制表符或逗号分隔。
- 第一行是样本名称（包括一个用于标识特征/物种的列名，例如`FeatureID` 或 `OTUID`）。
- 第一列是特征/物种的标识符（例如OTU ID、ASV ID或物种名）。
- 从第二列开始，每一列代表一个样本，内容是该特征在该样本中的丰度值。
- 数据可以是原始计数、相对丰度或经过标准化后的值，Lefse对丰度范围不敏感，但建议使用标准化后的数据（如相对丰度）。
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元数据/Mapping文件： 也是一个文本文件（.txt或.csv）。
- 第一列必须与输入数据表的样本名称完全一致，作为连接两个文件的桥梁。
- 其余列是样本的各种属性信息，例如分组信息（Treatment, Control）、协变量（Age, Sex）等。
- 非常重要： 必须有一列明确指定你想要进行组间比较的“主分组变量”（Class或Group）。
- 如果需要进行分层分析或考虑协变量，还需要指定“子分组变量”（Subclass）或“实验单元”（Subject/Case）。
- 分类学文件（可选但强烈推荐用于微生物数据）： 对于微生物数据，通常还需要一个将FeatureID映射到完整分类学路径的文件。Lefse可以使用这个信息来构建Cladogram并在不同分类级别进行分析。格式通常是`FeatureID \t k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Gammaproteobacteria…`。
请仔细查阅你使用的在线平台提供的具体数据格式示例和说明，因为不同平台可能有细微差别。确保文件没有格式错误（如空格、特殊字符、编码问题）。
上传数据
登录选定的在线平台后，通常会有一个“上传数据”或“导入数据”的选项。通过网页界面选择你准备好的输入数据表、元数据文件和（如果需要）分类学文件，然后上传到平台的工作空间。
参数设置
上传数据后，在平台的工具列表中找到“Lefse”工具。点击进入后，需要配置分析参数：
- 输入文件： 选择你刚才上传的数据表、元数据和分类学文件。
- 分组变量 (Class)： 从元数据文件中选择用于定义主要组别的列名。例如，如果你的元数据中有叫“Condition”的列，包含“Disease”和“Healthy”两个值，你就选择“Condition”。Lefse将在这两个组之间进行比较。
- 子分组变量 (Subclass，可选)： 如果你的数据有嵌套结构（例如，不同处理组下面还有不同的个体），或者你想控制某个协变量的影响，可以选择一个子分组变量。这会在组内进行额外的Wilcoxon检验。
- 实验单元 (Subject/Case，可选)： 如果你的设计是配对样本或重复测量设计，可以选择一个列来标识配对或重复的单元。
- LDA分值阈值 (LDA score threshold)： 设置一个阈值，只有LDA分值大于此阈值的特征才会被报告为差异特征。常用值是2.0或3.0。较高的阈值会得到更少的、差异更显著的特征。
- Kruskal-Wallis P值阈值： 设置Kruskal-Wallis检验的显著性水平。常用值是0.05。
- Wilcoxon P值阈值： 设置Wilcoxon检验的显著性水平。常用值是0.05。
- 其他选项： 可能还有P值校正方法（如BH校正）、是否生成特定图表等选项。
根据你的研究设计和对结果严格程度的要求来设置参数。
启动分析
设置完所有必要参数后，点击“运行”或“提交”按钮启动分析。在线平台会将你的任务提交到计算队列中。分析时间取决于数据量大小、服务器负载和参数设置。完成后，平台会通知你（通常是在页面上显示完成状态或发送邮件）。
【lefse在线分析】怎么解读分析结果？
分析完成后，最重要的是理解输出结果代表的意义。
结果文件概览
在线平台通常会将结果打包成一个或多个文件供下载，或者直接在网页上展示关键图表。常见的输出文件包括：
- 差异特征列表文件： 通常是一个`.txt` 或 `.res` 文件，包含表格数据。
- Cladogram图文件： 通常是矢量图格式（如`.svg`）或位图格式（如`.png`）。
- Bar Plot文件： 也是图格式（`.svg`, `.png`）。
- 其他中间文件： 平台可能还会提供分析过程中产生的中间文件，这些通常用于调试或高级用户。
Cladogram图解读
Cladogram是Lefse结果最具代表性的可视化形式之一。
- 结构： 它是一个从中心向外发散的树状图。中心代表最高分类级别（如界Kingdom），向外分支代表越来越低的分类级别（门Phylum、纲Class、目Order、科Family、属Genus、种Species）。
- 颜色： 如果某个节点（一个分类单元）或分支被着色，说明该分类单元在某种条件下显著富集。不同的颜色代表不同的分组。例如，红色分支表示该分类单元在“疾病组”中显著富集，绿色分支表示在“健康组”中富集。
- 节点： 树上的圆圈或节点代表一个具体的分类单元。如果节点被着色，说明这个分类单元在所属组中差异显著。
- 解释： 沿着彩色分支从中心向外看，可以找到在某个组中显著富集的所有分类单元，直到最低级别。例如，一条红色的分支一直延伸到一个特定的“属”级别节点，这表明从较高分类级到这个属，其中的微生物都倾向于在红色代表的组中丰度更高。
注意： Cladogram只显示那些被Lefse识别为差异的分类单元。未着色的分支或节点表示在该分析条件下，该分类单元没有在任何组间检测到显著差异。
Bar Plot (LDA Score Plot) 解读
LDA分值条形图提供了每个差异特征的效应量大小。
- 轴： Y轴通常列出所有被识别的差异特征（物种或OTU/ASV），或者按LDA分值排序；X轴表示LDA分值。
- 条形颜色： 每个条形的颜色对应于该特征在哪一组中显著富集，与Cladogram中的颜色一致。
- 条形长度： 条形的长度（LDA分值的绝对值）代表了该特征在不同组间差异的效应量大小。条形越长，差异越显著。
- 解释： 这个图直接告诉你哪些特征的差异最大。通过查看颜色，你可以知道它们是在哪个组中更高丰度。这有助于确定最具潜力的生物标志物候选。例如，一个在疾病组中具有很高LDA分值的细菌属，可能与疾病状态密切相关。
差异特征列表解读
文本格式的列表提供了最详细的定量信息。
这个表格通常包含以下列：
- Feature： 差异特征的名称（如物种名、OTU ID或基因名）。对于微生物数据，如果使用了分类学信息，这里可能是完整的分类学路径。
- Class： 该特征在哪一组中显著富集。
- LDA Score： 该特征的LDA分值。这是衡量效应量大小的核心指标，数值越大表示差异越大。
- Kruskal-Wallis P-value： Kruskal-Wallis检验的P值。它用于判断该特征在所有组之间是否存在总体差异。
- Wilcoxon P-value (pairwise comparisons)： 如果有子分组或多于两个主分组，这里可能包含配对Wilcoxon检验的P值，用于判断子组内或特定组对之间的差异。
- Mean Abundance in Class： 该特征在富集组中的平均丰度。
- Mean Abundance in Other Classes： 该特征在其他组中的平均丰度。
解释： 这个列表是查找具体差异特征的源头。你可以根据LDA分值进行排序，找到效应量最大的特征。同时，查看P值可以验证差异的统计学显著性。结合平均丰度，可以更直观地了解差异的实际大小。通常，LDA分值高且P值显著的特征是我们关注的重点。
下载结果
在解读结果后，务必将重要的图表和列表文件下载到本地保存，以便后续的报告撰写、论文发表或进一步的数据挖掘。在线平台通常会在结果页面提供下载链接或按钮。
总而言之，Lefse在线分析提供了一个强大且用户友好的方式来识别复杂生物数据中的差异特征。通过理解“是什么”、“为什么”以及“如何”使用和解读结果，研究人员可以有效地利用这些在线工具，从数据中提取有价值的生物学信息。
