荧光显微镜是什么、为什么用、哪里用、如何工作、种类与应用详解

【荧光显微镜】是什么？工作原理是什么？

荧光显微镜是一种利用物质荧光特性进行观察的显微镜。与传统的明场显微镜通过光线穿透或反射样本来成像不同，荧光显微镜依赖于样本中特定分子（即荧光团，Fluorophore）在吸收特定波长的光（激发光，Excitation Light）后，发射出更长波长的光（发射光，Emission Light）的原理。

其核心工作原理可以概括为：

1. 一个强大的光源（如汞灯、氙灯或激光）发出包含多种波长的光。
2. 激发滤光片（Excitation Filter）只允许能被荧光团吸收的特定波长光通过。
3. 这束激发光通过一个二向色镜（Dichroic Mirror或Beam Splitter），被反射到物镜（Objective Lens）。
4. 物镜聚焦激发光照射样本。如果样本中存在荧光团并被激发光照射到，它们会吸收能量并进入激发态。
5. 处于激发态的荧光团迅速弛豫并以发射光的形式释放能量。发射光的波长比激发光更长。
6. 这些发射光穿过物镜，返回到二向色镜。二向色镜被设计成能反射激发光但透射发射光。
7. 透射的发射光通过发射滤光片（Emission Filter）。这个滤光片只允许特定波长的发射光通过，进一步阻挡残余的激发光和其他背景光。
8. 纯净的发射光最终到达检测器（如CCD、CMOS相机或人眼），形成只显示荧光团位置和强度的图像。

简而言之，荧光显微镜通过“点亮”样本中带有荧光标记的特定结构或分子来成像，使得这些特定目标在黑暗的背景下显得明亮。

【荧光显微镜】为什么被广泛使用？相比其他显微镜有何优势？

荧光显微镜之所以成为现代生命科学、材料科学等领域不可或缺的工具，主要在于其独特的优势：

• 高特异性（Specificity）： 这是荧光显微镜最核心的优势。通过选择性地将荧光团标记到样本中感兴趣的特定分子、细胞器、细胞类型甚至特定基因序列上，研究者可以只看到这些被标记的目标，而忽略其他未被标记的部分。这使得在复杂背景中研究特定目标成为可能，例如在细胞中观察特定蛋白质的定位和运动。
• 高灵敏度（Sensitivity）： 荧光信号可以在极低的浓度下被检测到。单个荧光分子在合适的条件下甚至可以被观察到。这对于研究微量物质或跟踪稀疏分布的目标至关重要。
• 多色成像（Multi-color Imaging）： 可以同时使用多种不同发射波长的荧光团标记样本中的多个不同目标。通过使用不同的激发/发射滤光片组合，可以在同一视野中同时或顺序地观察到多种荧光信号，从而研究不同组分之间的空间关系和相互作用。
• 活细胞成像（Live Cell Imaging）： 许多荧光蛋白（如GFP及其变种）和一些荧光染料对细胞毒性较低，可以在活细胞中表达或导入，使得研究者能够观察细胞内部动态过程，如细胞迁移、蛋白转运、信号通路激活等实时变化。
• 高对比度（High Contrast）： 荧光信号通常出现在几乎没有背景光（黑色）的视野中，产生非常高的信噪比和对比度图像，使得目标结构清晰可见。
• 定量研究（Quantitative Analysis）： 通过测量荧光强度，可以在一定程度上对标记物质的丰度进行定量分析。结合FRET、FRAP等技术，还可以研究分子间的相互作用或分子动力学。

相比之下：

明场显微镜： 主要依赖样本对光的吸收或散射形成对比，通常用于观察染色后的组织切片或细胞形态，特异性较低，无法区分特定分子。

电子显微镜： 提供极高的分辨率，可以看到亚细胞结构甚至分子细节，但通常需要复杂的样本处理（如固定、脱水、包埋、切片、染色），且无法用于活细胞成像，也难以进行多分子标记。

因此，当需要观察特定分子、研究动态过程、进行多组分分析或需要高灵敏度时，荧光显微镜是首选工具。

【荧光显微镜】在哪里被使用？具体应用案例有哪些？

荧光显微镜的应用领域极其广泛，几乎涵盖了所有需要观察微观世界中特定目标的学科。

生命科学与医学

• 细胞生物学： 研究细胞骨架结构、细胞器分布、蛋白定位与运输、膜动力学、细胞周期等。例如，用荧光标记肌动蛋白研究细胞爬行，用内质网特异性荧光染料观察其形态变化。
• 分子生物学： 利用荧光原位杂交（FISH）技术定位细胞核中的特定基因序列或RNA分子；利用免疫荧光（Immunofluorescence, IF）技术检测特定蛋白质的表达水平和亚细胞定位。
• 神经科学： 追踪神经元的形态和连接；观察神经活动相关的钙离子信号（使用钙离子指示剂）；研究突触功能。
• 微生物学： 研究细菌、真菌或病毒的结构、感染过程以及与宿主细胞的相互作用。例如，用荧光蛋白标记细菌研究其在宿主组织中的分布。
• 发育生物学： 追踪胚胎发育过程中细胞的命运、迁移和形态发生。
• 病理学与临床诊断： 进行免疫病理诊断，检测组织或细胞中的特定抗原（如肿瘤标志物、病毒抗原）；进行染色体异常分析。
• 药物研发： 高通量筛选（High Throughput Screening, HTS）中用于检测药物对细胞或分子的影响；研究药物在细胞内的分布和靶点结合。

材料科学与化学

• 聚合物科学： 研究荧光标记聚合物的结构、形态和结晶过程。
• 纳米科学： 观察荧光纳米颗粒在材料中的分布或在生物体内的行为。
• 化学反应： 监测溶液或界面上的荧光化学反应过程。
• 质量控制： 检测材料表面或内部的微小缺陷，如裂纹或杂质（如果它们具有或可以被标记上荧光）。

其他领域

• 食品科学： 检测食品中的特定成分或污染物。

• 环境科学： 检测水样或土壤中的特定微生物或污染物。
• 半导体工业： 检测晶圆表面的微小缺陷或颗粒。

这些仅仅是冰山一角，荧光显微镜的应用还在不断拓展。

【荧光显微镜】如何进行样本制备？

有效的样本制备是获得高质量荧光图像的关键。制备方法取决于样本类型（细胞、组织、活体、材料等）以及研究目标（活细胞动态过程还是固定细胞结构）。

对于生物样本（细胞、组织）

活细胞成像

• 培养： 将细胞在合适的培养皿或培养板中生长，通常底部是玻璃（对荧光成像友好）。
• 荧光标记：
  • **荧光蛋白表达：** 通过基因转染或转导技术将编码荧光蛋白融合靶蛋白的基因导入细胞，使细胞自身表达带荧光的蛋白。这是活细胞成像中最常用的方法（如GFP、RFP、YFP等）。
  • **活细胞染料：** 使用一些可以进入活细胞并特异性标记某些细胞器（如线粒体、内质网）、离子（如钙离子）或生理状态（如膜电位）的荧光染料。需要控制染料浓度和孵育时间以避免毒性。
  • **量子点：** 某些表面修饰的量子点也可用于活细胞标记，但其毒性仍需谨慎评估。
• 培养环境： 将培养皿放在显微镜的载物台上，需要提供稳定的环境，如37°C温度、5% CO2浓度，以维持细胞活性。可能需要使用专门的活细胞成像平台。

固定细胞或组织成像

• 固定（Fixation）： 使用化学固定剂（如甲醛、多聚甲醛）或物理方法（如低温）迅速杀死细胞并固定其结构和分子位置。目的是保留样本的形态结构，同时尽量减少荧光团的扩散。
• 通透（Permeabilization）： 如果标记目标位于细胞内部（如细胞质或细胞核），需要使用去污剂（如Triton X-100）处理细胞膜，使其产生小孔，方便抗体或染料进入细胞内部。
• 封闭（Blocking）： 使用封闭液（如含白蛋白或血清的溶液）封闭样本中非特异性结合位点，减少荧光标记物的非特异性结合，降低背景荧光。
• 标记（Staining）：
  • **免疫荧光（Immunofluorescence, IF）：** 使用荧光标记的抗体特异性结合目标蛋白。可以直接使用荧光标记的一抗（直接法），或使用未标记的一抗结合目标，再使用荧光标记的二抗结合一抗（间接法，信号放大效果好）。
  • **荧光染料：** 使用特异性结合某些结构（如DAPI或Hoechst染DNA，Phalloidin染肌动蛋白）的荧光染料。
  • **荧光原位杂交（FISH）：** 使用荧光标记的核酸探针与样本中的特定核酸序列退火结合。
• 洗涤（Washing）： 每次标记后都需要充分洗涤，去除未结合的标记物，降低背景。
• 复染（Counterstaining）： 可以使用与其他标记物不同发射波长的荧光染料复染细胞核（如DAPI）或其他结构，以提供位置参照。
• 封片（Mounting）： 将染色好的样本放在载玻片上，滴加封片剂（Mounting Medium）。封片剂通常含有抗荧光淬灭剂（Anti-fade Reagents），用于减缓荧光信号的衰减（光漂白）。再盖上盖玻片。对于高分辨率成像，盖玻片的厚度和质量至关重要。

对于材料样本

材料样本的制备方法差异很大，可能包括切割、抛光、包埋，然后根据需要进行表面染色或内部示踪。如果材料本身具有荧光或包含荧光标记物，可能只需要简单的切片或准备一个适合显微镜观察的平面。

总的来说，样本制备需要仔细设计实验方案，选择合适的荧光标记物、制备步骤和成像条件，以最大化目标信号并最小化背景和损伤。

【荧光显微镜】如何获得高质量的图像？如何优化和避免常见问题？

获得高质量荧光图像涉及多个环节的优化和对潜在问题的规避。

优化成像参数

• 选择合适的物镜： 根据需要的分辨率和视野选择物镜。高数值孔径（NA）的物镜能收集更多荧光信号，提供更好的亮度和分辨率。油镜或水镜通常比干镜有更高的NA。
• 选择合适的荧光团和滤光片组合： 确保激发光源、激发滤光片、二向色镜和发射滤光片的组合与所用荧光团的激发和发射光谱匹配良好。不匹配会导致信号弱、背景高。
• 曝光时间（Exposure Time）： 控制相机曝光时间。过短可能信号不足，图像暗淡；过长可能导致像素饱和（信号溢出，图像出现亮斑，丢失细节）和光漂白（荧光信号快速衰减）。理想的曝光时间应使最亮部分的像素值接近但未达到相机最大值。
• 相机增益（Gain）： 增加增益可以放大信号，使图像变亮。但同时也会放大背景噪声。应优先通过增加曝光时间或提高激发光强度来增加信号，在信号较弱时再适当增加增益。
• 激发光强度： 适当的激发光强度可以获得更强的荧光信号。但过高的强度会加速光漂白和光毒性（对活细胞有害）。应使用最低可接受的激发光强度。
• 聚焦（Focus）： 精确聚焦是基本要求。对于有厚度的样本，可能需要获取一系列不同焦平面的图像（Z-stack），然后进行投影或三维重建。
• 选择合适的采集模式： 单帧采集、延时采集（Time-lapse for dynamics）、Z轴扫描（Z-stack for 3D）、多通道采集（Multi-channel for multi-color）。

避免和解决常见问题

• 光漂白（Photobleaching）： 荧光团在反复激发下会永久性失去发光能力。
  • 解决方法： 降低激发光强度；缩短曝光时间；使用抗荧光淬灭封片剂；使用光稳定性更好的荧光团；限制对感兴趣区域的重复照射；如果可能，使用共聚焦或光片显微镜等技术减少对非焦平面的激发。
• 自发荧光（Autofluorescence）： 样本自身或制备过程中使用的材料（如某些固定剂、塑料器皿、玻璃载玻片）可能发出荧光，增加背景。
  • 解决方法： 使用玻璃底的培养皿/载玻片；选择低自发荧光的固定剂；充分洗涤去除残留化学物；使用自发荧光低的封片剂；使用近红外区域的荧光团（自发荧光通常在短波长）；利用共聚焦显微镜的光学切片能力减少背景。
• 非特异性染色（Non-specific Staining）： 荧光标记物（尤其是抗体）结合到非目标位置，导致背景升高或错误信号。
  • 解决方法： 优化封闭步骤，使用合适的封闭液；调整抗体或染料浓度；充分洗涤；使用特异性更好的抗体或染料；进行阴性对照实验（如不加一抗或使用同型对照抗体）。
• 散射光和反射光： 激发光在样本内部或光学元件表面散射/反射进入发射光路，增加背景。
  • 解决方法： 确保滤光片和二向色镜性能良好且正确安装；使用优质物镜；共聚焦显微镜可以有效阻挡非焦平面的散射光。
• 样本漂移（Drift）： 活细胞样本在长时间观察过程中可能因为温度变化、蒸发或机械振动而发生位置移动。
  • 解决方法： 使用稳定的活细胞成像平台；使用封闭的培养皿或加油/水密封；在显微镜启动并稳定一段时间后再开始采集；使用图像分析软件进行漂移校正。
• 折射率不匹配： 介质（浸镜油、水、封片剂）与盖玻片或样本之间的折射率差异会导致图像畸变和信号损失，尤其在使用高NA物镜时。
  • 解决方法： 确保使用与物镜匹配的浸镜介质（如油镜使用浸油）；如果使用水镜，确保样本浸在水中；选择折射率与样本相近的封片剂。

【荧光显微镜】有多少种类型？它们有什么区别？

荧光显微镜根据其光学设计和成像原理的不同，发展出了多种类型，以满足不同的研究需求。它们在分辨率、成像速度、光学切片能力、对样本的损伤程度等方面有所区别。

基本类型

• 宽场荧光显微镜（Widefield Fluorescence Microscope）：
  • 原理： 用激发光均匀照射整个视野的样本。样本中所有处于激发光路径上的荧光团（包括焦平面和非焦平面）都会被激发并发出荧光。物镜收集这些荧光信号形成二维图像。
  • 特点： 结构相对简单，成本较低，成像速度快。但最大的缺点是存在严重的非焦平面荧光干扰，导致图像模糊，无法进行光学切片。适用于观察薄样本或进行快速、低分辨率的活细胞观察。
• 共聚焦荧光显微镜（Confocal Fluorescence Microscope）：
  • 原理： 使用点扫描的方式成像。激发光通过针孔（Pinhole）聚焦成一个点照射样本。发射光通过同一个（或共轭的）针孔后到达检测器。这个检测针孔只允许来自物镜焦平面上的光信号通过，而阻挡来自非焦平面上的光信号。通过二维扫描（XY方向）和Z轴步进，可以获得一系列无模糊的光学切片，进而构建三维图像。
  • 特点： 具有出色的光学切片能力，图像对比度高，分辨率略优于宽场。能够进行三维成像和定量分析。缺点是成像速度相对较慢（特别是大视野或深层样本），对光漂白和光毒性相对敏感（因为激发光聚焦到小点）。系统复杂，成本较高。

其他类型（通常基于宽场或共聚焦原理的改进）

• 全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRF）：
  • 原理： 激发光以大于临界角入射，在盖玻片与样本界面发生全内反射，在界面产生一个快速衰减的“倏逝波”（Evanescent Wave）。只有紧贴界面的样本区域（约100-200 nm厚度）被激发产生荧光。
  • 特点： 具有极高的轴向分辨率（Z方向），能最大限度地减少背景荧光，特别适合观察细胞膜、细胞膜下的分子事件、表面吸附或分子与表面的相互作用。无法观察细胞内部或更深层结构。
• 光片荧光显微镜（Light Sheet Fluorescence Microscope, LSFM 或 SPIM）：
  • 原理： 使用一个独立的物镜将激发光聚焦成一个薄的光平面（光片）照射样本的某个薄层。另一个垂直于光片的物镜收集来自这个薄层的发射光进行成像。通过移动样本或光片，可以快速获取整个样本的三维图像。
  • 特点： 成像速度极快，对样本的光损伤和光漂白非常小，特别适合长时间、大体积、活体样本的三维动态成像（如胚胎发育）。对样本的固定和安装有特殊要求。
• 超高分辨率荧光显微镜（Super-resolution Fluorescence Microscopy）：
  • 原理： 这是一系列打破光学衍射极限（约200 nm）的显微技术，能够实现数十纳米甚至单个分子的分辨率。主要技术包括：
    • STED (Stimulated Emission Depletion)
    • SIM (Structured Illumination Microscopy)
    • PALM (Photoactivated Localization Microscopy) / STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
    • MINFLUX (Minimal Emission Flux) 等。
  • 特点： 提供前所未有的空间分辨率，能够解析细胞内部更精细的结构和分子分布。技术复杂，设备昂贵，通常对样本和荧光团有特定要求，成像速度可能较慢（取决于技术）。
• 转盘共聚焦显微镜（Spinning Disk Confocal Microscope）：
  • 原理： 使用一个包含大量微透镜和针孔阵列的快速旋转圆盘。圆盘将激发光分成大量并行光束同时扫描样本的不同区域。发射光通过对应的针孔到达相机。
  • 特点： 成像速度比点扫描共聚焦快得多，适合高速的三维活细胞成像，光漂白和光毒性也相对较低。光学切片能力略逊于点扫描共聚焦，串扰可能略高。

选择哪种类型的荧光显微镜取决于具体的科研问题、样本特性、需要的分辨率、成像速度和预算。

【荧光显微镜】设备购置成本和运行成本大概是多少？

荧光显微镜的成本差异巨大，从基础的宽场系统到先进的超高分辨率或活体成像系统，价格可以相差一个数量级甚至更多。

购置成本（估算，随配置、品牌、地区和时间波动较大，仅供参考）

• 基础宽场荧光显微镜： 这种通常是实验室入门级的荧光系统，可能基于研究级的正置或倒置显微镜平台加装荧光附件（荧光光源、滤光块、荧光物镜、相机）。
  • 价格范围：几万元到十几万元人民币。
• 研究级宽场荧光显微镜： 更专业的科研平台，配备更高性能的光源（如LED）、电动载物台、滤光片轮、更高分辨率的相机和图像采集软件。
  • 价格范围：十几万元到几十万元人民币。
• 共聚焦荧光显微镜（点扫描或转盘）： 系统复杂，包含激光器、扫描振镜（点扫描）或高速转盘（转盘）、高灵敏度检测器（如PMT或高速相机）。
  • 价格范围：几十万元到数百万元人民币。高端多光子共聚焦或活体共聚焦系统价格更高。
• 超高分辨率显微镜（STED, SIM, PALM/STORM等）： 这些是目前最先进的系统，光学设计和硬件要求极高。
  • 价格范围：数百万元到上千万元人民币。
• 光片荧光显微镜： 根据配置不同，价格也有较大差异。
  • 价格范围：数十万元到数百万元人民币。

除了显微镜主机本身，还需要考虑配套设备和软件的成本，如：

• 高性能的图像采集电脑和工作站。
• 图像分析软件（一些基础软件免费，但高级分析软件通常需要额外付费）。
• 活细胞成像附件（温控、CO2控制、湿控）。
• 样本制备设备（如离心机、孵箱、超净工作台等）。

运行成本（经常被忽视的部分）

• 荧光光源： 汞灯或氙灯有有限的使用寿命，需要定期更换（几千到一万多元/个）。LED光源寿命长得多，但初次购买成本较高。激光器的寿命也有限，且维修或更换成本很高。
• 滤光片和二向色镜： 如果需要观察新的荧光团或进行多色成像，可能需要购买额外的滤光片组，价格通常在几千到一万多元/套。
• 物镜： 高性能物镜非常昂贵，如果损坏更换成本高。
• 耗材： 活细胞培养耗材、各种荧光染料、抗体、封片剂、浸镜油等，这些是持续性的支出。
• 维护和维修： 高精度光学仪器需要定期维护，出现故障时维修费用可能很高，特别是激光器和扫描系统。可能需要购买延长保修服务。
• 人员成本： 操作和维护复杂的荧光显微镜需要经过专门培训的人员。
• 电力和环境控制： 特别是共聚焦和超分辨系统，对电力稳定性和环境温度湿度有要求。

因此，购置荧光显微镜需要综合考虑初次投入和长期的运行维护成本，并评估其是否符合实验室的科研需求和预算。在大学或研究机构，通常会设立共享平台，以提高设备的使用效率并分摊成本。